有些条件下不适合做反转录聚合酶链式反应，那么反转录聚合酶链式反应的局限性是什么呢？

反转录聚合酶链式反应需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列，而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这些序列，这样，通过反转录聚合酶链式反应得到的探针就有可能与多个基因序列杂交。

而利用反转录聚合酶链式反应可对未知序列扩增后进行分析，探索邻接已知DNA片段的序列，并可将仅知部分序列的全长cDNA进行分子克隆，建立全长的DNA探针。适用于基因游走、转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。